Dua Dimensi

BAB I

PENDAHULUAN

                                                A. Latar Belakang  

Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan palingkuat dilaboratorium kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannyayang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif.Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semuacuplikan, dan kromatografi preparatif hanya dilakukan juka diperlukan fraksimurni dari campuran.

Metode pemisahan senyawa dengan kromatografi sudah umum digunakan namun dalam pemilihan metode kromatografi cair vakum  disebabkan karena metode pemisahan ini menggunaan pompa vakum sehingga pemisahan senyawa lebih baik dan menggunakan eluen dengan tingkat kepolaran yang berbeda serta alat yang digunakan sederhana.

Kromatografi ialah cara pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan zat-zat terlarut yang bergerak bersama-sama dengan pelarutnya pada permukaan suatu benda penyerap. Cara ini umum dilakukan pada pemisahan zat-zat berwarna (bahasa Yunani: chromos = warna).

Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah : Kromatografi Kertas (KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Gas Cair (KGC) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).(2) Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan dan keatsirian senyawa yang akan dipisah.

Adapun metode yang dapat digunakan untuk memisahkan suatu campuran yang mengandung banyak kompenen berupa modifikasi KLY yaitu KLT dua dimensi dan pengujian kemurnian suatu senyawa dapa dilakukan dengan KLT melti eluen yang selanjutnya akan dibahas.

                                           B. Maksud dan Tujuan

Adapun maksud dilakukannya percobaan kali ini adalah untuk mengetahui dan memahami cara pemisahan senyawa padahasil isolat sampel ekstrak daun Daun johar (cassia folium)menggunakanKLT Multi Eluen Dan KLT Dua Dimensi.

Adapun tujuan dilakukannya percobaan kali ini adalah untuk memperoleh hasil dari profil kromatogram berupa fraksi-fraksi darihasil isolat sampel ekstrak daun bunga Daun johar (cassia folium) menggunakanKLT Multi Eluen Dan KLT Dua Dimens

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Suatu metode pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip partisi dan adsorpsi antara fase diam (adsorben) dan fase gerak (eluen), komponen kimia bergerak naik mengikuti cairan pengembang karena daya serap adsorben (silica gel) terhadap komponen-komponen kimia tidak sama sehingga komponen dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda berdasarkan tingkat kepolarannya dan hal inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan (Adnan, 1978).

Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fitokimia atau merupakan salah satu metode identifikasi awal untuk menentukan kemurnian senyawa yang ditemukan atau dapat menentukan jumlah senyawa dari ekstrak kasar metabolit sekunder.Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi adsorpsi dan adsorben bertindak sebagai fase stasioner (Markham, 1988).

Kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk mengetahui apakah senyawa hasil isolasi sudah murni.Apabila noda yang dihasilkan hanya satu, maka kemungkinan hasil isolasi tertentu adalah murni.Akan tetapi untuk memastikannya perlu dilakukan variasi pelarut yang digunakan sebagai pengelusi.Jika elusi dengan variasi pelarut tetap memberikan noda tunggal, maka dapat diperkirakan senyawa hasil isolasi sudah murni (Markham, 1988).

Lapisan yang memisahkan terdiri dari atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah, berupa larutan, ditotolkan berupa bercak kemudian plat dimasukkan di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan) dan selanjutnya senyawa tidak berwarna harus ditampakkan. Pereaksi noda pada plat KLT bervariasi tergantung dari senyawa yang akan diamati. Untuk noda yang mengalami fluoresensi warna pengamatan noda dapat dilakukan dengan lampu UV pada serapan panjang gelombang 254 nm dan 365 nm (Markham, 1988).

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 µm. Semakin kecil ukuran rata-rata pertikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya (Markham, 1988).                    

Lempeng KLT disiapkan dengan melapiskan penjerap ke permukaan lapisan kaca, gelas, atau aluminium dengan ketebalan 250 µm. Lempeng KLT telah tersedia di pasaran dengan berbagai ukuran dan telah ditambah dengan reagen fluoresen untuk memfasilitasi deteksi bercak solut. Di samping itu, lempeng KLT yang tersedia di pasaran sudah ditambah dengan reagen fluoresen untuk memfasilitasi deteksi bercak solut.Di samping itu, lempeng KLT yang tersedia di pasaran sudah ditambah dengan agen pengikat, seperti kalsium sulfat (Gandjar, 2008).

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar.Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal (Gandjar, 2008).

Multi eluen adalah penggunaan eluen atau fase gerak yang berbeda yang memungkinkan pemisahan analit dengan berdasarkan tingkat polaritas yang berbeda (Ibnu, 2008).

Dalam multi eluen, setelah pengembang tunggal menaik,kromatogram diangkat dari chamber dan dikeringkan, biasanya selama 5-10 menit. Kromatogram tersebut kemudian dielusi lagi dalam eluen segar dari pelarut yang sama dalam arah yang sama untuk jarak yang sama.Proses ini, yang dapat diulang berkali-kali, meningkatkan resolusikomponen dengan nilai RF bawah 0,5. Beberapa pengembang dilakukandengan pelarut yang berbeda dalam arah yang sama, masing-masingyang menjalankan jarak yang sama atau berbeda, disebut elusi bertahap. Sebuah fase kurang polar dapat digunakan pertama, diikuti oleh faseyang lebih polar, atau sebaliknya. Pemindahan material nonpolar kebagian atas lapisan, meninggalkan zat terlarut polar terganggu darimana dia berasal. Setelah kering, zat terlarut polar dipisahkan olehpengembang dengan eluen (Fried,1999).

KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusisampel ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimiayang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimanadalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangatberbeda dapat digunakan secara berurutan sehingga memungkinkan untukmelakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda (Ibnu, 2008).

Sampel ditotolkan pada lempeng lalu dikembangkan dengan satusystem fase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90°, dan diletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak kedua, sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak dibagian bawah sepanjang lempeng, lalu dikromatografi lagi (Ibnu, 2008).

Zat identifikasi oleh 2D-TLC juga sering dilakukan dalam penyelidikan phytopharmaceuticals, yang biasanya memiliki komposisiyang kompleks. Dari sudut pandang logis, 2D-KLT menggunakan pelarutyang sama dalam dua arah harus sistem yang terbaik. Namun, ini tidakbiasanya menyebabkan informasi tambahan, karena semua zat akanberbaring pada diagona. Metode 2D-KLT hanya menjadi menarik jikareaksi telah terjadi antara dua eluen, dan penyimpangan dari garisdiagonal dapat diamati setelah elusi kedua(Hahn, 2007).

Dalam hal untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untukmemilih dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatanpelarut yang sama ini cukup sulit tetapi penting (Wall, 2005).

Secara singkat pengerjaan KLT dua dimensi ialah sebagai berikut:Sampel ditotolkan pada lempeng lalu dikembangkan dengan satusistemfase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengansalah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90°, dandiletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak kedua,sehinggabercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletakdibagian bawahsepanjang lempeng, lalu dikromatografi lagi         (Rohman, 2009).

Keberhasilan pemisahan akan tergantung pada kemampuan untukmemodifikasi selektivitas eluen kedua dibandingkan dengan selektivitasdari eluen pertama (Satari, 1999).

Pemisahan 2-D yang terbaik TLC adalah ketika semua komponendipisahkan dan didistribusikan pada seluruh permukaan dari pelatkromatografi. Estimasi pemisahan ini dapat dibuat dengan sebuah fungsiobjektif. Umumnya, kesepakatan yang baik antara evaluasi visual darikromatogram dan evaluasi komputer menggunakan fungsi objektif adalahmelihat. Di sisi lain., fungsi yang diperlukan yang dapat memprediksi nilaiRf dari satu komponen fungsi komposisi dari fase gerak . Ada programuntuk simulasi kromatogram yang sebanding dengan yang diperolehdengan percobaan kromatogram (Satari, 1999).

BAB III

PROSEDUR KERJA

A. Alat yang dipakai

Adapun alat yang dipakai adalahbatang pengaduk, chamber, gelas kimia, gunting, lampu UV 254 nm dan 366 nm, lempeng KLT, mistar, pensil 2B, pinset, pipa kapiler, sendok tanduk besi.

B. Bahan yang digunakan

Adapun bahan yang digunakan adalah aluminium foil, DPPH, ekstrak n-heksan daun johar (cassia siamea), Eluen n-heksan :etilasetat (7:3)danetil asetat : aseton (1:1), kapas, kertas saring, label, pelarut n-heksan, silika gel, tissue.

       C. Cara Kerja

a.    Multi eluen

1.    Disiapkan alat dan bahan

2.    Disentrifuse hasil kerukan KLTP dalam tabung dengan n-heksan :etil asetat (7:3)dan etil : aseton (1:1)

3.    Diuapkan dan setelah itu di sediakan lempeng yang sudah diaktifkan

4.    Ditotolkan sampel pada lempeng yang berbeda

5.    Disiapkan perbandingan eluen dari yang non-polar hingga polar

6.          Dilihat penampakannya di lampu UV 254 nm dan UV 366 nm.

b.    KLT dua dimensi

1.    Disiapkan alat dan bahan

2.    Dilarutkan ekstrak dengan methanol

3.    Ditotolkan pada lempeng yang telah diaktifkan

4.    Dibuat perbandingan eluen n-hexan:etilasetat = 8: 2 dan 6 : 4

5.    Dimasukkan kedalam chamber, dielusi dan dikeringkan

6.    Diputar 90^o setelah mencapai batas atas, lalu dielusi lagi, setelah elusi kedua mencapai batas atas, dikeluarkan dari chamber dandikeringkan

7.    Dilihat penampakan nodanya pada UV 254 nm dan UV 366 nm

BAB IV

HASIL

IV. 1    Gambar Hasil Pengamatan

a.    KLT Multi eluen

UV 366

Keterangan

1.    Eluen : N-Heksan : Etil asetat (7:3)

b.    KLT DuaDimensi

UV 254	UV 366

Keterangan:

1.    Eluen n –hexan:etil asetat(8: 2)

2.    Eluen n –hexan:etil asetat (6 : 4)

BAB V

PEMBAHASAN

Kromatografi adalah suatu tekhnik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.

Adapun tujuan dilakukannya percobaan kali ini adalah untuk memperoleh hasil dari profil kromatogram berupa fraksi-fraksi darihasil isolat sampel ekstrak daun johar (cassia siamea) menggunakanKLT Multi Eluen Dan KLT Dua Dimensi.

Multi eluen adalah penggunaan eluen atau fase gerak yang berbeda yang memungkinkan pemisahan analit dengan berdasarkan tingkat polaritas yang berbeda.

KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda

Adapun identifikasi bercak yang dilakukan pada pegujian Kromatografi lapis tipis multi eluen dan dua dimensi yaitu :

a.    Pada UV 254 nm

          Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan tampak berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada lempeng.Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi.

b.    Pada UV 366 nm

          Pada UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda tersebut.Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi.Sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak berfluororesensi pada sinar UV 366 nm.

Berdasarkan percobaan dapat disimpulkan bahwa daun johar (cassia siamea) didapatkan hasil pada KLT multi eluen terdapat noda yaitu pada UV 366 danuntuk KLT dua dimensi terdapat noda pada UV 254.

BAB V

PENUTUP

V.1 Kesimpulan

Berdasarkan percobaan dapat disimpulkan bahwa daun johar (cassia siamea) didapatkan hasil pada KLT multi eluen tidak terdapat noda.

V.2 Saran

Sebaiknya praktikan lebih teliti agar didapat hasil yang akurat dan sebaiknya menggunakan tanaman yang diketahui memiliki khasiat sebagai obat.

DAFTAR PUSTAKA

Adnan, Mochamad, (1978), “Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan”, ANDI Yogyakarta, Yogyakarta.

Fried, Bernard &Sherma, Joseph. (1999).Thin Layer Chromatography,4thEdition, Revised and Expanded. New York:Marcel Dekker. Inc8.

Gandjar, I. G., dan Rohman, A. (2007). Kimia Farmasi Analisis. Cetakan II.  Yogyakarta: Pustaka pelajar.

Hahn-Deinstrop, Elke.(2007). Applied Thin-Layer Chromatography,Best Practiceand Avoidanceof Mistakes.Second, Revised andEnlarge Edition.Jerman: WILEY-VCH

Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.

Markham,K.R.1988.CaraMengidentifikasi Flavonoida.Terjemahan Kosasih Padmawinata. ITB : Bandung.

Rohman, Abdul. (2009).Kimia FarmasiAnalisis. Yogyakarta: PustakaPelajar.

Satari, RR. (1999).PenelitianProdukAlamLaut Indonesia, ArahdanProspek.Jakarta.

Wall, Peter E. (2005).Thin-Layer Chromatography, A Modern Practical Approach. UK: RS.C7.