BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar
Belakang
Pengobatan tradisional yang menggunakan
bahan-bahan alam telah sangat berkembang hingga saat ini, dan sangat menarik
minat masyarakat pada umumnya untuk kembali menggunakan bahan-bahan alam
sebagai obat karena mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan dengan obat-obat
sintesis. Oleh sebab itu perlu dilakukan pemisahan senyawa benrmanfaat dari
tamanan untuk dapat di manfaatkan secara maksimal.
Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan
yang sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun
kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering
menjadi obyek molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk
keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam
pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak,
vitamin dan molekul penting lainnya. Dengan data-data yang didapatkan dengan
menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat
ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis
obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut
sehingga bisa bertahan lama.
Kromatografi kolom merupakan teknik
kromatografi yang paling awal ditemukan dari mekanismenya, kromatografi kolom
merupakan terapan atau absobsi yang tidak boleh larut dalam fasa gerak, ukuran
partikel fasa diam harus seragam. Zat
pengotor yang terdapat pada fasa diam
dapat menyebabkan absobsi tidak reversible sebagai fasa diam digunakan alumina,
silica gel, arang, bauksit, magnesium karbonat, kalsium karbonat, talk, pati,
sekelator, gula dan tanah diatom.Fasa gerak pada kromatografi kolom dapat berupa pelarut tunggal atau campuran beberapa
pelarut polar dan nonpolar. Umumnya senyawa nonpolar dengan berat molekul lebih cepat meninggalkan fasa
diam
I.2 Maksud
dan Tujuan Percobaan
I.2.1 Maksud
Adapun maksud dari percobaan ini yaitu untuk mengetahui dan memahami
cara penggunaan serta prinsip kerja kromatografi kolom konvensional menggunakan fraksinasi kasardaun Johar (Cassia folium).
I.2.2 Tujuan
Adapun tujuan percobaan ini yaitu untuk memisahkan
senyawa kimia fraksinasi kasardaun Johar (Cassia folium)menggunakan kromatografi kolom konvensional berdasarkan warna dan tingkat kepolaran.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Pada
kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada
bagian atas kolom, penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau
bahkan tabung plastik. Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui
kolomkarena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan
tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda,
memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom. Metode
ini mdrupakan contoh kromatografi elusi karena linarut dielusi dari kolom
(Sastrohamidjojo, 1985).
Kromatografi
kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak digunakan.
Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang
banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan
adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion.
Cara pembuatannya ada dua macam (Wijayakusuma, 1996):
a.
Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom
yang telah diberi kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi.
b.
cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan
dengan cairan pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom
melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua,
sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah
silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran
ditutup dan sampel dimasukkan yang terebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai
diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke
dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan
kran dibuka dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan
yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi.
Dalam
kromatografi lapis tipis, fase diam adalah lapisan tipis jel silikaatau alumina
pada sebuah lempengan gelas, logam atau plastik. Kolomkromatografi berkerja
berdasarkan skala yang lebih besar menggunakanmaterial terpadatkan pada sebuah
kolom gelas vertikal (Sudjadi,1994).
Kolom
yang terbuat dari gelas diisi dengan fase diam berupa serbuk penyerap (seperti
selulosa, silika gel, poliamida). Fase diam dialiri (dielusi)dengan fase gerak
berupa pelarut (Gritter,1991).
Sampel
yang mengandung campuran senyawa dituangkan ke bagian atas dari kolom, kemudian
dielusi dengan pelarut sebagai fase gerak. Setiap senyawa/komponen dalam
campuran akan didorong oleh fase gerak dan sekaligus ditahan oleh fase diam.
Kekuatan senyawa ditahan oleh fase diamakan berbeda dengan senyawa lainnya.
Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan dengan kromatografi kolom adalah fase
diam yang digunakan, kepolaran pelarut (fase diam),ukuran kolom (diameter dan
panjang kolom), kecepatan alir elusi (Gritter,1991).
Untuk
kromatografi kolom , kolom tertentu diisi dengan bahan penjerap /sorpsi dan
pelarut pengembang dengan tingkat kepolaran yang berbeda. Kolom yang diisi
dengan bahan penjerap /sorpsi yang disebut kolom pemisah. Penggunaan kolom tergantung
dari masalah pemisahan yaitu kolom berfilter dengan gelas bepori, yang pada
ujung bawah menyempit (tabung allihn) atau tabung gelas yang pada bagian bawah
menyempit dan dilengkapi dengan kran
sedangkan tabung bola jarang digunakan. perbandingan panjang tabung trhadap
diameter pada umumnya ialah 40:1. Pengisian kolom dengan adsorben yang juga
disebut pengemasan kolom , harus dilakukan dengan hari-hari dengan permukaan
yang rata. Aluminium oksida atau silika gel dapat dikemas dengan metode kering kedalam
kolom . Agar pemisahan rata, tabung diisi sambil diketuk-ketuk menggunakan
tangan atau benda lunak lainnya pada dinding kolom (Stahl,1991).
Kolom kromatografi atau tabung untuk
pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau sistem bertekanan rendah
biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan kranUkuran keseluruhan kolom
beragam beragam , tetapi biasanya penjang sekurang-kurang 10 kali garis tengah
dalammnya dan mungkin juga sampai 100 kalinya. Ukuran kolom banyaknya penjerap
ditentukan oleh bobot campuran linarut (ekstrak) yang akan dipisahkan .Sifat
,derajat atau tingkat keaktifan penjerap da ukuran partikelnya betul-betul
penting dalam pengembangan sistem kromatografi . Ukuran penjerap biasanya lebih
besar daripada untuk KLT . Kemasan kolom biasanya 63-250 meter untuk kolom yang
dijalannkan oleh gaya gravitasi (Raymond et
al,2006).
Ada 3
pendekatan yang digunakan untuk memilih
pelarut meliputi (Anonim,2013) :
1.
Penelusuran
pustaka
Pemilihan pelarut berdasarkan pendekatan ini biasanya
dilakukan pada senyawa yang telah diketahui atau dipublikasikan
2.
Berdasarka
profil KLT
Pendekatan ini akan mempermudah penentuan sistem eluen
yang digunakan pada proses kolom karena dapat dilakukan dalam waktu singkat
dengan jumlah pelarut yang lebihh hemat sebelum diterapkan pada kolom. Intinya
sistem eluen KLT dapat diterapkan langsung pada sistem eluen kolom jika sedah
dianggap cocok.
3.
Landaian
bertahap
Sistem landain bertahap mengikiti sistem deret eluotropi.
Pendekatan ini mulai dari kepolaran terendah sampai tertinggi untuk mendapatkan
hasil kromatogram yang sesuai.
Pengemasan
Fase Diam /penjerap
1.
Cara
kering ( Raymond et al. 2006)
Selapisan kapas/pasir bersih
diletakkan didasar kolom, penjerap dituangkan kedalam kolom sedikit demi
sedikit.Setiap pernambahan silika gel, permukaannya diratakan dan
dimanpatkan.Alat pemanpat ini dapat berupa sumbat karet/bahan lunak yang
dipasang pada ujung batang kaca atau gagang stik.
Setelah semua penjerap dimasukkan,
pada bagian atas dilapisi kertas saring sehingga jika ditambahkan eluen,
permukaan penjerap tetap rata.Eluen kemudian dimasukkan menggunakan pipet tetes
secara memutar sambil membuka kran kolom pada bagian bawah.Eluen dibiarkan
mengalir ke bawah melalui dan membasahi penjerap sampai eluen tersebut tepat
sampai dikran kolom.
2.
Cara
basah ( Raymond et al. 2006 )
Selapisan kapas/pasir bersih
dimasukkan kedalam kolom, dan tabung diisi sepertiga dari volume kolom. Pelarut
yang dipakai dalam proses pengemasan sama dengan pelarut yang akan digunakan
pada kromotografi atau pelarut yang kepolarannya lebih rendah. Penjerap dibuat
lumpuran menggunakan eluen tersebut lalu
dituangkan kedalam kolom. Lumpurkan dapat dimasukkan sekaligus atau
sedikit demi sedikit.
Selama
proses pengemasan, tabung dapat diketuk-ketuk pada semua sisi secara
perlahan-lahan dengan sumbat karet atau bahan yang lunak agar diperoleh lapisan
yang seragam. Kran dapat dibuka atau ditutup selama penambahan, namun tetap
memperhatikan permukaan pelarut agar tetap merendam seluruh permukaan penjerap.
Hal ini untuk mencegah masuknya udara dalam ruang antar partikel silika gel
yang dapat menyebabkan gangguan pada proses isonasi.
Jika pelarut yang dipakai untuk
membuat lumpuran berbeda dengan pelarut yang dipakai pada kromotografi, pelarut
lumpuran harus didesak keluar dengan
pelarut pengelusi terlebih dahulu
sebelum cuplikan ditambahkan.
3.
Cara
kemas basah
Cara ini dapat dibuat dengan mengisi
tabung setengahnya dengan pelarut, lalu penjerap dalam keadaan kering
dimasukkan kedalam kolom berupa aliran halus melalui corang .penjerap dibiarkan
mengendap sementara tabung diketuk-ketuk ( seperti cara basah dan kering) agar
terbentuk kemasan yang seragam dan mampat. Jika penjerap dimasukkan seluruhnya
sekaligus, biasanya diperoleh kemasan fasediam dalam kolom yang sangat baik. Pelarut berlebih
dikeluarkan dari tabung agar diperoleh kolom penjerap dan dapat pula
ditambahkan selapisan pasir yang telah dicuci untuk menutupi kertas saring.
Keterbatasan
kromatografi kolom-terbuka klasik ialah sebagai berikut (Gritter,1991):
1. Pemisahan
lambat
2. Penjerapan
eluen yang tidak bolak-balik
3. Tidak dapat
dipakai jika partikel terlalu kecil.
BAB III
PROSEDUR KERJA
III.1 Alat dan
Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah batang pengaduk, botol UC, cawan porselin, gelas kimia, gelas ukur, kertas saring, sendok tanduk besi, klem, pipet tetes, statif, timbangan analitik, vial.
Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalahaluminium foil, fraksi
dietil eterdaun Johar (Cassia folium), etil-Asetat, kapas, kertas
saring,methanol, n-Hexan, silica gel kasar, tisu.
III.2 CaraKerja
1.
Penyiapan Kolom Kromatografi Kolom Konvensional
Alat-alat perangkat kromatografi kolom dicuci dengan
metanol dan dikeringkan; Dirangkai alat kolom dan ditegakkan dengan bantuan
statif dan klem.
2.
Pengemasan suspensi Silika
Ditimbang silika kasar sebanyak 40 gram, Silika disuspensikan dengan denganpelarut n-Hexan; Dihomogenkan
sampai tercampur merata sampai pelarutnya menguap menguap semua dan setelah itu
dimasukkan ke dalam kolom.
3.
Penyiapan fraksi
Disiapkan alat dan bahan; Ditimbang fraksi sebanyak 1 gram; dan fraksi siap digunakan
4.
Prosedur Kerja Kromatografi Kolom Konvensional
Disiapkan alat dan bahan; Kolom yang telah dipasang
dimasukkankapas pada ujung kolom (dasar kolom);dimasukkan kertas saring: Dimasukkan suspensi silika yang telahdisiapkan
secara perlahan-lahan; Ditunggu beberapa saat sehingga mampat; Dimasukkan
kertas saring; Dimasukkan sampel perlahan-lahan; Dimasukkan perbandingan eluen
satu-satu mulaidari non-polar hingga polar, perbandingannya yaitu: n-Heksan:
Etil Asetat9:1,
8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7,
2:8, 1:9, dan 0:10. Masing-masing
eluen dibuat 50 mL; Ditampung dalam vial hinggamencapai volume 5 mL dan
dipisahkan berdasarkan warna.
BAB
IV
HASIL
a.
Hasil
Kromatografi Kolom Konvensional
1.
Gambar
Kromatografi Kolom Konvensional
2.
Gambar
Hasil Fraksi-Fraksi Kromatografi Kolom Konvensional
Fraksi
1 Fraksi
2
Fraksi
3 Fraksi
4
Fraksi
5 Fraksi
6
Fraksi
7 Fraksi
8
Fraksi
9 Fraksi
10
Fraksi
11 Fraksi
12
pemisahan fraksi berdasarkan warna
3.
Gambar Noda
Lempeng
4.
Gambar Lempeng dibawah UV
BAB V
PEMBAHASAN
Kromatografi kolom konvensional adalah metode
kromatografi klasik yang sampai saat ini masih banyak digunakan. Kolom
kromatografi digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah banyak.
Prinsip dari kromatografi kolom jenis ini adalah kecenderungan komponen kimia
untuk terdistribusi ke dalam fase diam atau fase gerak dengan proses elusi berdasarkan
gaya gravitasi.
Prinsip
kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya
serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam
sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir
kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat
sehingga turun lebih lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah
dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh
bahan penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut /
dengan tanpa tekanan udara masin-masing zat akan bergerak turun dengan
kecepatan khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom
Sistem
pelarut dilakukan dengan cara menggantikan / mengubah kepolaran dari eluen yang
digunakan secara bertahap. Eluen tersebut merupakan campuran dua jenis pelarut
dengan kepolaran berbeda.Dengan mengubah perbandingan campurannya kita dapat
menggeser tingkat kepolaran dari eluen ini.Pada pengerjaannya di awali dengan
satu jenis pelarut yaitu berupa heksan saja, kemudian digeser tingkat
kepolarannya dengan mencampurkannya dengan pelarut etil asetat.Pencampuran
dilakukan dengan perbandingan yang divariasikan secara bertahap, hingga
diakhiri dengan hanya menggunakan etil asetat saja sebagai eluen.Dengan ini
diharapkan dapat memberikan pemisahan yang lebih baik.
Eluen
dialirkan untuk pemisahan komponen dengan kecepatan alir sekitar 100 tetesan
per menitnya.Aliran eluen diatur agar tidak terlalu cepat agar komponen dapat
terpisah. Alirannya pun diusahakan tidak terlalu lambat agar proses tidak
terlalu lama. Eluen mengalir mengelusi sampel menyusuri fase diam di sepanjang
kolom dengan memanfaatkan gaya gravitasi.
Dengan
adanya perubahan tingkat kepolaran secara bertahap, keterikatan komponen
terhadap pelarut dan keterikatan masing-masing komponen terhadap fase diam akan
berubah-ubah, sesuai dengan sifat-sifat masing-masing komponen.. Komponen ini
dibawa oleh pelarut dan tertampung pada vial penampung. Hasil pemisahan dapat
diakumulasikan dan masih dalam keadaan terlarut dalam pelarut.
Proses
pemisahan pada kromatografi kolom ini bisa dikatakan sebagai bentuk sederhana
dari teknik kromatografi yang dilakukan dengan instrument kinerja tinggi. Kita
juga bisa melakukan pemisahan dengan jenis eluen lain, atau dengan jenis
absorben lainnya. Kolom di sini hanya sebatas berfungsi sebagai wadah.Bahan
yang digunakan sebagai fase diam dapat berupa macam, baik itu dengan memanfaatkan
prinsip partisi ataupun absorbsi.
Vial-vial tersebut secara berurutan akan mengandung
senyawa nonpolar yang akan ditarik oleh senyawa non polar pula sebagai eluen.
Itulahsebabnya dalam pembuatan eluen harus dibuat senyawa non polar ke
polar.Penambahan eluen harus dilakukan 2 cm diatas sampel untukmenghindari
sampel dan silica kering, sebab jika pada bagian silika ada yangbasah dan
kering akan menyebabkan tidak meratanya eluen yang akandigunakan selanjutnya.
Keuntungan kromatografi kolom
1. Hasil partisi
yang diperoleh sangat bagus, sebab elusi terjadi secarawajar tanpa ada tekanan
dari alat lain serta waktu kontak antara eluen.
2. Dapat digunakan
pada sampel dengan sampel yang jumlah yang sedikit
3. Silika yang sudah
digunakan dapt dicuci kembali sehingga lebih hemat
Kerugian kromatografi kolom
1. Prosesnya tidak
hemat waktu
2. Alatnya
konvensional dengan membutuhkan keahlian khusus dalam penggunaannya
BAB VI
KESIMPULAN
Berdasarkanhasilpercobaanini,
makadapatdisimpulkanbahwa dari hasil kromatografi kolom konvensional di peroleh
sebanyak 10 fraksi yang
dipisahkan berdasarkan tingkat kepolaran dan 6 fraksi berdasarkan perbedaan warna.
DAFTAR
PUSTAKA
Anonim.,
2013., “Penuntun Praktikum Fitokimia II”.,UMI;
Makassar
Sudjadi.,
1994., “Metode Pemisahan”.,Kanisius,
Yogyakarta.
Gritter
J.R, dkk., 1991., “Pengantar Kromatografi”.,
Penerbit ITB, Bandung.
Raymond G.
Reid and Satyajit D. Sarker, 2006.Isolation
of natural Product by Low-Pressure Collum Chromatografi in Sharker SD.,
Latif,Z and Gray , Al (ED). Natural Product Isolation Humana Press.Inc. Totowa
New jersey
Sastrohamidjojo, Dr.H., 1985, ”Kromatografi”, Penerbit Liberty,
Yogyakarta,
Stahl, E.1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopis.
Terjemahan kosasih P., Iwang S., Penerbit ITB ;Bandung.
Wijaya, Kusuma Hembing, 1996, “Tanaman Berkhasiat Obat di Indonesia”,
Jilid IV, Pustaka Kartini, Jakarta.
LABORATORIUM FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUSLIM INDONESIA
Tidak ada komentar:
Posting Komentar